A mezotripszinogén pathobiokémiája

 

Bevezetés: A hasnyálmirigy exokrin funkciója, a tripszinek jelentősége.
A humán hasnyálmirigy exokrin funkciója az emésztőenzimek (proteázok, nukleázok, lipáz, foszfolipáz, amiláz) termelése, amelyek a Wirsung-vezetéken keresztül a patkóbélbe kerülnek elválasztásra és a tápanyagok lebontásában vesznek részt. A fehérjebontó enzimek inaktív, ún. zimogén formában szintetizálódnak és kerülnek szekrécióra. Fiziológiás körülmények között a zimogének inaktívak maradnak a hasnyálmirigyben és csak a duodenum lumenében történik meg aktiválásuk. Ennek első lépéseként a duodenális kefeszegélyben elhelyezkedő enzim, az enteropeptidáz hasít le egy oktapeptidet a tripszinogén amino-terminális végéről, majd az így képződött tripszin aktiválja a többi proteolítikus zimogént (kimotripszinogén, proelasztáz, prokarboxipeptidáz) a megfelelő aktív proteázzá. A tripszin katalizálja önmaga képződését is tripszinogénből, ezt autoaktivációnak hívjuk [1]. A korán (még a hasnyálmirigyen belül) aktiválódott tripszin molekulákat a védő funkciójú pankreatikus szekretoros tripszin inhibitor, továbbiakban PSTI, köti meg. Hasonlóan a proteázokhoz, a foszfolipáz és a kolipáz is zimogén formában kerül szekrécióra és ezeket a proenzimeket is a tripszin aktiválja a béllumenben.
A fentiekből kitűnik, hogy a tripszin centrális szerepet játszik az emésztésben, nemcsak mint emésztőenzim, hanem mint egy sor másik enzim aktivátora is. A tripszin abnormális viselkedése elsődleges kóroki tényező lehet, ezért a pancreatitis kutatások középpontjába került.
A humán hasnyálban a tripszinogénnek két fő izoformája található, a kationos és az anionos tripszinogén. Az elnevezés onnan ered, hogy gélelektroforézis során az egyik gyorsabban vándorol az anód felé (ez az anionos forma) mint a másik (ezt hívjuk kationos tripszinogénnek). Normálisan a kétféle forma aránya kettő az egyhez a kationos forma javára [2]. Ismerünk még egy harmadik formát is, ez a mezotripszinogén, ami az összes tripszinogénnek mindössze 3-10%-a és vándorlási sebessége elektroforézis során az anionos és a kationos izoenzim közé esik [3-5].

Célkitűzések:
• A mezotripszinogén funkcionális jellemzése, biológiai funkció keresése.
• Az evolúciós G198R mutáció szerepének vizsgálata a mezotripszin működésében.
• A mezotripszinogén mutációinak szerepe az örökletes hasnyálmirigy-gyulladás mechanizmusában.
• A mezotripszinogén kifejeződésének és központi idegrendszeri szerepének kutatása.

A mezotripszin funkciója az emésztésben: Az evolúciós G198R mutáció szerepének vizsgálata a mezotripszin működésében.
A mezotripszin a humán hasnyálmirigy különleges emésztőenzime, amelyet Rinderknecht fedezett fel 1978-ban [6]. A figyelem középpontjába szokatlan inhibitor-rezisztenciája miatt került. A cDNS-ét megklónozták 1997-ben [7], és 2002-ben egy magyar munkacsoport a kristályszerkezetét is meghatározta [8]. A mezotripszinről szerzett nagy mennyiségű strukturális ismeret ellenére az enzim biológiai funkciója rejtett maradt. Az erősen csökkent gátolhatóság két alapvető hipotézist vet fel, a mezotripszin funkcióját tekintve: (1) A gátlószer által nem uralható proteáz aktivitás a hasnyálmirigyen belül szöveti önemésztődéshez, következményes hasnyálmirigy betegséghez vezethet; (2) ugyanakkor a korán aktiválódott mezotripszin a két fő izoformát degradálva, így azok idő előtti aktiválódását megakadályozva, védő szerepet is betölthet a hasnyálmirigy működésében.
Az aminosav sorrend és a kristálystruktúra analízise alapján a szokatlan inhibitor-rezisztencia hátterében egyetlen evolúciós mutáció sejthető, amelynek hatására a fehérje 198-as glicinje argininre cserélődik. A humán mezotripszin kivételével, a kimotripszin-szerű szerin proteázokban a 198-as glicin evolúciósan megőrzött. Az arginin hosszú oldallánca térben akadályozza az inhibitor proteinek és feltehetően egyéb fehérje szubsztrátok kötődését, hiszen a specificitást meghatározó aszparaginsav (194-es) és a katalitikus szerin (200-as) szomszédságában található.
Egyik célunk a Arg 198 szerepének vizsgálata a mezotripszin funkciójában. Ezért a rekombináns gén irányított mutagenezisével a mezotripszinben a 198-as arginint glicinre kell cserélni, és az így kapott R198G mutáns enzimet a vad típusú mezotripszinnel funkcionálisan összehasonlítani a tripszin-inhibitorokkal való gátolhatóságot és a zimogén aktivációt alapul véve. A rekombináns proteázokat Escherichia Coliban fejezzük ki és ekotin-affinititás kromatográfiával tisztítjuk. A katalitikus paraméterek és a fehérje természetű szubsztrátokkal való interakció vizsgálata fotometrián alapuló enzimaktivitás-méréssel történik kis molekulasúlyú szintetikus szubsztráton.

A herediter pancreatitis: a mezotripszinogén mutációk jelentősége.
Az idiopátiás krónikus hasnyálmirigy-gyulladás egyik formája, az örökletes (herediter) pancreatitis, dominánsan öröklődő autoszomális kórkép. Tipikusan gyermekkorban kezdődően enyhébb-súlyosabb heveny pancreatitis rohamok képében jelentkezik, melyek idővel a krónikus pancreatitis kórképéhez vezetnek, sőt nem ritka, hogy később pancreastumor alakul ki. Whitcomb és mtsai 1996-ban azonosították az első herediter pancreatitishez kapcsolódó mutációt a humán kationos tripszinogén génjében [9], és ezt hamarosan további mutációk felfedezése követte, nemcsak a tripszinogén génben hanem a pancreatikus szekretoros tripszin inhibitor (PSTI) génjében is. A herediter pancreatitis felismerése nem elsősorban az elváltozás gyakorisága miatt igen fontos, hanem azért, mert amellett szól, hogy emberi hasnyálmirigy-gyulladásban az elsődleges kóroki tényező a tripszinogén vagy tripszin inhibitor abnormális viselkedése, a tripszinképződés zavara lehet. A tripszin közvetlen kóroki szerepét állatokon mesterségesen előidézett pancreatitis esetében igazolták is, de az emberi betegségben hasonló bizonyíték nem állt rendelkezésre [10]. Nem véletlen tehát, hogy a herediter pancreatitis a hasnyálmirigy gyulladásos megbetegedéseinek egyik fontos humán modellje lett.
A javasolt kutatóprogram egyik célkitűzése a mezotripszinogén mutációk (elsősorban a del32 [11]) hatásának vizsgálata a fehérje szerkezetére és működésére. A hatás-szerkezeti vizsgálataink arra keresnének választ, hogy milyen mechanizmussal okozhatnak a mutációk fokozott tripszin aktivitást és hasnyálmirigy-gyulladást. Ebben a tekintetben előzetes eredményeink arra utalnak, hogy a mutáns tripszinogének fokozott autoaktivációja vagy a tripszin-inhibitor mutánsok csökkent működése állhat a herediter pancreatitis pathogenezisének középpontjában [1,12]. Kísérleteinkkel ezt a hipotézist kívánjuk megerősíteni vagy megcáfolni.

A mezotripszinogén kifejeződése és szerepe a központi idegrendszerben.
A pancreatikus tripszinogének kisebb mennyiségben termelődhetnek más szövetekben is. Tripszinogén mRNS vagy fehérje kimutatható volt tumorszövetekben, a gyomor-bél traktus hámsejtjeiben és a központi idegrendszerben[13], de az enzim(ek) funkciója az extra-pancreatikus szövetekben tisztázatlan maradt.
Kutatóprogramunk egyik célkitűzése a mezotripszinogén agyi kifejeződésének és szerepének vizsgálata. Feltételezzük, hogy az agyi mezotripszin is a pankreatikus izoformához hasonló katalitikus tulajdonságokkal rendelkezik, és endogén proteáz inhibitorokkal való sajátságos interakciója révén vesz részt egyes idegrendszeri folyamatok szabályozásában. Első feladatunk lesz a transzkripciós start hely és a "core promoter" pontos meghatározása. Ezen információk birtokában a transzkripciós faktorok kötőhelyeinek feltérképezése és a mezotripszinogén génszekvencia elemzése lesz a fő kutatási irányvonal. A gén promoter régiójában elhelyezkedő transzkripciós faktor kötőhelyek electrophoretic mobilty shift assay (EMSA) technikával elemezhetők. A módszer lényege, hogy jelölt kettősszálú DNS-próbák és fehérjék (transzkripciós faktorok) kölcsönhatását vizsgáljuk oly módon, hogy amennyiben a DNS-fehérje kapcsolat létrejön, azaz a transzkripciós faktor kötődik a feltételezett kötőhelyhez a DNS-próbában, akkor a keletkezett komplex mobilitása a szabad próbáéhoz képest jelentősen lecsökken [14]. Az EMSA-hoz hagyományosan 32P-jelölt próbát alkalmaznak (rEMSA), ez a módszer igen érzékeny és megbízható, a radioaktív jelölés miatt azonban veszélyes és különleges felszereltséget igényel. A DNS-próba jelölésére azonban fluoreszcens festék (Cy5) is eredményesen alkalmazható (fEMSA), emellett az elektroforetikus analízis kapillárisban történhet. Ezen technika érzékenységét, specificitását és felbontóképességét tekintve épp oly eredményes, mint a hagyományos radioaktív eljárás, emellett azonban lényegesen könnyebben kivitelezhető, veszélytelen és megfelelően automatizálható [15]. Végül a mezotripszin promoter transzkripciós faktorainak in vitro vizsgálatával olyan szekvencia variánsokat tervezünk kidolgozni, amelyek különbözőképpen kötik a fehérjéket, így megismerhetjük a kötődés specificitásában jelentős tényezőket.

Várható eredmények:
A mezotripszin a legkevésbé ismert tripszin izoforma, amelynek a hasnyálmirigy enzimek között feltűnően egyedülálló sajátossága a rezisztenciája természetes inhibitorokkal szemben. A meglepő rezisztencia hátterében a kristálystruktúra és a protein szekvencia alapján a 198-as arginin szerepe feltételezhető. A vad típusú és a rekombináns gén irányított mutagenezisével kialakítandó R198G mutáns mezotripszin funkcionális összehasonlítása enzimaktivitás mérés és poliakrilamid gélelektroforézis segítségével történik. Ezzel kísérletes bizonyítást nyerhet az a feltételezés, miszerint egyetlen aminosav áll az inhibitor rezisztencia hátterében. Emellett megismerhetjük a mezotripszin zimogén aktiváló illetve degradáló képességét, melyek megerősíthetik betegséget okozó vagy éppen védő intra-pancreaticus funkcióját. A mérések során a mezotripszinogén zimogén aktiválhatóságát is teszteljük különböző hasnyálmirigy enzimekkel illetve a pathológiás aktivátor katepszin B-vel.
A javasolt kutatóprogram másik célkitűzése a mezotripszinogén mutációk hatásának vizsgálata a hasnyálmirigy egyéb fehérjéinek szerkezetére és működésére. A hatás-szerkezeti vizsgálatainkban arra kaphatunk választ, hogy milyen mechanizmussal okozhatnak a mutációk fokozott vagy éppen csökkent tripszin aktivitást és következményes hasnyálmirigy-működészavart.
Végül a mezotripszin agyi izoformájának promoter régióját feltérképezve és az enzim kifejeződését vizsgálva megtudhatjuk, hogy keletkezik-e funkcionális fehérje az agyi izoenzim génjéről és megismerhetjük a transzkripciós faktor kötődés specificitását meghatározó tényezőket. Ez a vizsgálat kaput nyithat az agyi izoforma központi idegrendszeri szerepét feltérképező kutatóprogramok előtt.

IRODALOM

1. Sahin-Tóth, M. and Tóth, M. (2000) Gain-of-function mutations associated with hereditary pancreatitis enhance autoactivation of human cationic trypsinogen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 278, 286-289.
2. Kukor, Z., Tóth, M. and Sahin-Tóth, M. (2003) Human anionic trypsinogen. Properties of autocatalytic activation and degradation and implications in pancreatic diseases. Eur. J. Biochem. 270, 2047-2058.
3. Rinderknecht, H., Renner, I. G. and Carmack, C. (1979) Trypsinogen variants in pancreatic juice of healthy volunteers, chronic alcoholics and patients with pancreatitis and cancer of the pancreas. Gut 20, 886-891.
4. Rinderknecht, H., Renner, I. G., Abramson, S. B. and Carmack, C. (1984) Mesotrypsin: a new inhibitor-resistant protease from a zymogen in human pancreatic tissue and fluid. Gastroenterology 86, 681-692.
5. Rinderknecht, H., Stace, N. H. and Renner, I. G. (1985) Effects of chronic alcohol abuse on exocrine pancreatic secretion in man. Dig. Dis. Sci. 30, 65-71.
6. Rinderknecht, H., Renner, I. G., Carmack, C., Friedman, R. and Koyama, P. (1978) A new protease in human pancreatic juice. Clin. Res. 26, 112A.
7. Nyaruhucha, C. N. M., Kito, M. and Fukuoka, S. I. (1997) Identification and expression of the cDNA-encoding human mesotrypsin(ogen), an isoform of trypsin with inhibitor resistance. J. Biol. Chem. 272, 10573-10578.
8. Katona, G., Berglund, G. I., Hajdu, J., Gráf, L. and Szilágyi, L. (2002) Crystal structure reveals basis for the inhibitor resistance of human brain trypsin. J. Mol. Biol. 315, 1209-1218.
9. Whitcomb, D. C., Gorry, M. C., Preston, R. A. et al. (1996) Hereditary pancreatitis is caused by a mutation in the cationic trypsiongen gene. Nat. Genet. 14, 141-45.
10. Steer, M. L. (1998) Frank Brooks Memorial Lecture: The early intraacinar cell events which occur during acute pancreatitis. Pancreas 17, 31-37.
11. Wiegand, U., Corbach, S., Minn, A., Kang, J. and Müller-Hill, B. (1993) Cloning of the cDNA encoding human brain trypsinogen and characterization of its product. Gene 136, 167-75.
12. Witt, H., Luck, W., Hennies, H. C., Clasen, M., Kage, A., Las, U., Landt, O. and Becker, M. (2000) Mutations in the gene encoding the serine protease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis. Nat. Genet. 25, 213-216.
13. Paju, A., Bjartell, A., Zhang, W. M., Nordling, S., Borgstrom, A., Hansson, J. and Stenman, U. H. (2000) Expression and characterization of trypsinogen produced in the human male genital tract. Am. J. Pathol. 157(6), 2011-21.
14. Revzin, A. (1989) Gel electrophoresis assays for DNA-protein interactions. Biotechniques 7(4), 346-55.
15. Ruscher, K., Reuter, M., Kupper, D., Trendelenburg, G., Dirnagl U. and Meisel, A. (2000) A fluorescence based nonradioactive electrophoretic mobility shift assay. J. Biotech. 78, 163-70.