Lefilmezték az agy működését

Háromdimenziós kép az egerek látókérgének működéséről

Az MIT kutatói éber, aktív egerek látókérgének valamennyi sejtrétegét élő időben meg tudták figyelni a legmodernebb háromfoton-mikroszkópia segítségével – sőt, még a kéreg alatt is találtak némi meglepetést.

Ahogy az orvosok egyre mélyebbre néznek a testünkbe az ultrahang, a CT és az MRI révén, és ahogy a csillagászok a világűr egyre messzibb vidékeit kémlelik az űrteleszkópok, alkalmazkodó optikák és különböző hullámhosszú fényre érzékeny detektorok segítségével, úgy igyekeznek az idegtudósok képalkotó módszereikkel egyre beljebb hatolni az agy mélységeibe, hogy az ott dolgozó idegsejtek működését kiismerjék. A háromfoton-mikroszkópia egyike a legfejlettebb technikáknak, amely minden eddiginél mélyebb bepillantást enged az agy belső rétegeibe. Az eljárás jelentős továbbfejlesztésének köszönhetően az MIT tudósai most először végezhettek olyan kísérletet, amelyben éber egerek látókérgében – a szemekből érkező bemenetet feldolgozó agykérgi területen – figyeltek meg stimuláció kiváltotta aktivitást. A kísérletben nemcsak a látókéreg valamennyi sejtrétegét tudták nyomon követni, de a rejtelmes kéreg alatti lemezbe – az ún. „subplate"-be – is beleláttak.

Filmfelvétel a működő agyról

„Az optikai kialakítást és az egyéb paramétereket az élő agyban történő mérésre optimalizáltuk, így olyan felfedezéseket tehettünk, amelyek korábban nem voltak lehetségesek – mondta el Mriganka Sur, a Massachusetts Institute of Technology (MIT) Picower Intézetének idegtudomány professzora és a Nature Communications című folyóiratban megjelent közlemény rangidős társszerzője. A cikk vezető szerzőségén két posztdoktori kutató, Murat Yildirim és Hiroki Sugihara osztozik, a másik rangidős szerző pedig Peter So mechanikai- és biomérnök professzor. Sur hozzátette: az elképzelés már létezett, de kérdés volt, vajon hogyan ültethető át a gyakorlatba.

A tanulmány írói bemutatják, hogy miközben az egerek különböző vizuális ingereket néztek, a kísérletet végző kutatók a látókérgük mind a hat sejtrétegében és a subplate-ben is meg tudták figyelni az idegsejtek aktivitási mintázatait, s ezzel új ismereteket szereztek arról, miként dolgozza fel az emlős agy a látási információt.

Körültekintően megtervezett kísérletekkel a tudósok azt is bizonyítani tudták, hogy sem az agyba beküldött, sem az onnan kibocsátott fény nem károsította a mérés célpontjául szolgáló idegsejteket, és még csak nem is befolyásolta a működésüket.

Összességében a cikk egy olyan új háromfoton-mikroszkópiás eljárásról számol be, amely úgy lett optimalizálva, hogy gyors, rövid és alacsony energiájú fényimpulzusok segítségével mélyen az agyban fekvő célterületeket lehessen vele vizsgálni azok funkcionális károsítása vagy megzavarása nélkül. A beküldött fotonok a génmódosított egerek idegsejtjeiben fluoreszcens jeleket gerjesztenek, amelyek kívülről nagy hatékonysággal detektálhatók, és ezek alapján éles, nagy térbeli és időbeli felbontású háromdimenziós filmfelvételek készíthetők a működő agyról.

Meg szerettük volna mutatni, mire vagyunk képesek a háromfoton-mikroszkópiás technológiával éber állatokon, és hogy ezzel fontos idegtudományi kérdésekre kereshetünk választ

– nyilatkozta Yildirim. – Nem elég azt gondolni, hogy nekünk van a legjobb mikroszkópunk a világon; fel is kell tennünk ezeket a kérdéseket, mert addig nem tudhatjuk, milyen eredményeket kapunk majd."

Évtizedekkel ezelőtt fektették le az alapokat

A többfoton-mikroszkópia elméleti alapjait Maria Goeppert Mayer német születésű amerikai elméleti fizikusnő fektette le 1931-ben írott doktori disszertációjával, amelyben megmutatta, hogy több, pontosan egy időben érkező kisenergiájú foton ugyanúgy gerjesztett állapotba tud hozni egy atomot vagy molekulát, mint egyetlen nagyenergiájú. Az elméletet először 1990-ben állították a biológiai képalkotás szolgálatába, amikor a Cornell Egyetemen megépítették a világ első kétfoton-mikroszkópját, majd 2013-ban ugyanitt munkába állították az első háromfoton-mikroszkópot is. Mivel annak biztosításához, hogy több foton egyidejűleg érkezzen be a célterületre, nagyon kis térfogatra kell fókuszálni a gerjesztő lézersugarat, ezek a mikroszkópok egyben pásztázó mikroszkópok is, vagyis háromdimenziós felvételek készítésére alkalmasak.

A többfoton-mikroszkópia további óriási előnye, hogy a gerjesztéshez használt kisenergiájú, nagy hullámhosszú fotonok áthatolóképessége sokkal jobb, mint a nagyenergiájúaké, mert kevésbé hajlamosak eltérülni vagy visszaverődni a sejthártyák lipidjeiről és az egyéb szöveti struktúrákról.

Mit láttak a kutatók?

Sur és So laboratóriumai egyesült erővel dolgoznak a többfoton-mikroszkópia lehetőségeinek kiterjesztésén, és a mostani tanulmánnyal bizonyítják, hogy már képesek vele élő időben követni a kísérleti állatok idegsejtjeinek tevékenységét. E cél érdekében a gerjesztő lézerfény és az optikai rendszer tulajdonságait az agyszövet jellemzőinek precíz mérései nyomán úgy finomhangolták, hogy a szöveti károsodás elkerülése mellett a lehető legjobb képminőséget érjék el. Nemcsak azt mérték ki, hogy mekkora energiánál kezdenek a sejtek nyilvánvalóan károsodni (ez nagyjából 10 nanojoule), hanem azt az energiát is meghatározták, ahol már épp kezd megváltozni a viselkedésük (ami 2-5 nanojoule-nak adódott). A pontosság és az energiaközlés minimalizálása érdekében a mikroszkópot úgy állították be, hogy hihetetlenül rövid, mindössze 40 femtoszekundumos (a femtoszekundum a másodperc milliomod részének milliárdod része) gerjesztő impulzusokat adjon le. Ehhez persze az optikát is aprólékosan hozzá kellett hangolni, hogy a gerjesztett molekulák által kibocsátott és a detektorhoz visszaérkező fény minden kis villanását összegyűjtse.

Forrás: AFP/SPL

Miután meggyőződtek róla, hogy a háromfoton-mikroszkóp mérései összhangban vannak a kétfoton-mikroszkópéival – amely csak a kevésbé mély kérgi rétegekig lát el –, illetve az elektrofiziológiai mérésekkel – amelyek mélyebbre hatolnak ugyan, de vakon, precíz térbeli felbontás nélkül –, a csoport az idegtudomány eddig meg nem hódított csúcsai felé vette útját: éber állatokban végezte el az idegi aktivitás közvetlen, az agykéreg valamennyi rétegére kiterjedő vizuális megfigyelését.

A kísérlet során az egereknek 12 különböző irányba elforgatott, kétféle irányban mozgó hálómintázatot mutattak egy képernyőn, ami a látást vizsgáló idegtudományi kísérletekben megszokottnak tekinthető felállás. A kísérlet különlegessége az volt, hogy ezúttal a látókéreg teljes, több mint egy milliméteres mélységében élő időben nyomon követték, hogyan reagálnak az egyes idegsejtek erre a sztenderd bemenetre. Az idegi aktivitás úgy vált láthatóvá, hogy egy génmódosított egértörzset alkalmaztak, amelynek az idegsejtjeiben a kalciumszint-emelkedésre – megfelelő gerjesztés esetén – fluoreszcens fénykibocsátással reagáló, GCaMP6s nevű fehérje fejeződik ki. A „harmadik harmonikus-képzés" néven ismert nemlineáris optikai jelenségnek hála a kutatók más szöveteket, így az ereket és az agy fehérállományát is képesek voltak vizualizálni.

Így, hogy a látókéreg valamennyi rétegét át tudták tekinteni, a tudósok megállapították, hogy az 5-ös réteg sejtjei úgymond „lazán" vannak az inger orientációjára hangolva, ami azt jelenti, hogy a mintázat-orientációk széles tartományára (és nem csak mondjuk egyre-kettőre) reagálnak.

Az is látszott, hogy az 5-ös réteg idegsejtjeinek magasabb a spontán aktivitása, mint a többi réteg sejtjeinek, és több kapcsolattal rendelkeznek az agy mélyebb területei felé. Eközben a 6-os réteg sejtjeinek pontosabb az orientáció szerinti hangolása, mint bármely más rétegének, vagyis fajlagosabban válaszolnak a különböző mintázatirányokra.

Háromdimenziós kép az egerek látókérgének működéséről Forrás: Murat Yildirim et. al.

A legnagyobb meglepetés azonban a kéreg alatti lemezzel, a subplate-tel volt kapcsolatos.

Kiderült, hogy ebbe a főleg idegrostokból, vagyis fehérállományból álló rétegbe olyan idegsejtek vannak beágyazódva, amelyek aktivitási mintázata gyengén és lazán hangolt módon ugyan, de kapcsolatban állt a vizuális bemenettel.

Ez a felfedezés azért volt megvilágító értékű, mert az idegtudósok többsége eddig úgy gondolta, hogy a subplate idegsejtjei zömmel csak az egyedfejlődés alatt aktívak, és a kifejlett agyban már elhallgatnak. Nem csoda, hogy ez a hiedelem alakult ki – vélekedik Yildirim –, hiszen a réteg túl vékony ahhoz, hogy az elektrofiziológiai mérések kimutassák a tevékenységét. „A kifejlett agyban – az in vivo képalkotás technikai nehézségei miatt – eddig soha nem tanulmányozták a kéreg alatti lemez idegsejtjeit" – írják a szerzők.