Genetikai információk gyorsabban, olcsóbban, egyszerűbben

Egy amerikai vállalat szabadalmaztatta DNS-leolvasó készülékét, amelyet az újgenerációs berendezések első képviselőjeként jegyeztek be, és amely rövidesen forgalomba kerül. Az új technológiának a jövőben meghatározó szerepe lehet az orvostudomány, a tudományos kutatások, a bűnüldözés, az archeológia és minden olyan tudományterület továbbfejlődésében, amely az örökítőanyag vizsgálatának gyakorlatát alkalmazza.

Leolvasás ma

A szekvencia leolvasásához manapság elsőként előállítják az ismeretlen bázissorendű DNS-molekula egyláncú változatát, s feldarabolják azt kisebb komponensekre. Ehhez azután rövid, valamilyen jelöléssel ellátott DNS-darabkákat (primereket) adnak hozzá, amelyek párosodnak az egyszálú DNS-darabok egyik végével. Erre azért van szükség, mert a kiegészítő szál kialakulását egy enzim végzi (DNS-polimeráz), ami nem tud az egyszálú DNS-hez kapcsolódni. Ez után a reakcióelegyet négyfelé osztják, s mindegyik elegybe külön-külön beviszik a DNS-t felépítő négyféle bázist tartalmazó nukleotidokat, plusz minden oldathoz meghatározott arányban hozzátesznek olyan módosított és a négyféle bázisnak megfelelően négyféle fluoreszcens jelet hordozó nukleotidokat is, amelyek ha beépülnek a kiegészítő szálba, akkor a szál kialakítását végző enzim "leesik" a DNS-ről, nem képes tovább építeni azt. Minden oldatba csak egyféle módosított, jelölt nukleotid kerül.

Így sok, különböző hosszúságú, kicsi DNS-darabka keletkezik, amelyek az eredeti szál kiegészítő, komplementer szekvenciájának egy-egy részletét hordozzák. A reakciókeverékeket ekkor egy közös reakciótérbe helyezik, ahol egy lézer alkalmazásával megjeleníthetővé válik az adott bázishoz tartozó fluoreszcens jel, azaz a fluoreszcencia színe jelenti az adott bázist, amely megfelel a beépült, módosított nukleotidnak. A színek egymásutánisága pedig megadja az eredeti egyszálú DNS kiegészítő szálának szekvenciáját.

Részben más megközelítés a "teljes genomrobbantás" (whole genom shotgun szekvenálás) módszere. Ekkor a genomi DNS-t véletlenszerűen mechanikai úton darabolják, majd az előző módszernek megfelelően elkezdik a leolvasást. A lényegi különbség a vizsgált szekvencia összeállításában van: itt annyi darabka leolvasását végzik el, ami a teljes genom sokszorosára (akár 10-15-szörösére) is elegendő lenne. Így rengeteg olyan szekvencia keletkezik, ami átfedésbe hozható egy vagy több másikkal. A darabokat ezután számítógéppel illesztik össze úgy, hogy a program megkeresi az egyes DNS-részek közötti szekvencia-átfedéseket.

Az újgenerációs szekvencialeolvasó készülék

A Harris és kollégái által kifejlesztett technológia sokban hasonlít az előbb vázoltakhoz, ám sokkal anyagtakarékosabban és gyorsabban képes mindezt kivitelezni. A szerkezet először feldarabolja a leolvasni kívánt DNS egyszálú formáját, majd minden egyes darabkához köt egy kis komplementer DNS-darabkát (taget), amely egy felülethez rögzíti a felaprított DNS-szálakat, és a kiegészítő szál felépítését végző enzimnek is elősegíti a kötődését. Ekkor hozzáadják a rendszerhez az enzimet, illetve a DNS-t felépítő négyféle nukelotidot, amelyeket különböző fluoreszcens jelöléssel látnak el. Egy kamerával felveszik a beépülő bázisok által kibocsátott fluoreszcens jeleket, s a szerkezet által kirajzolt színsor fog megfelelni az eredeti DNS-szál kiegészítő szekvenciájának.

Az új módszert magyarázó animáció

A vizsgálat során tehát nem fognak felszaporodni a különböző hosszúságú, 1-1 jelet hordozó DNS-darabkák, hanem egyesével leolvashatóvá válik a bázisok minősége. Ezzel amellett, hogy a leolvasás pontossága fokozódik, a reagensek jelentős hányada megspórolható. Így kevesebb befektetéssel, jóval rövidebb idő alatt pontosabb képet kaphatnak a genetikai információkról, amellyel rengeteg pénz spórolható meg a kutatások számára.

Amikor elkészülnek a jelölt nukleotiddal végződő komplementer DNS-darabok, azokat a rendszer egy közös reakciótérbe helyezi. Itt egy gélre kerülnek, amelyen elektromos áram hatására méretüknek megfelelő sebességgel mozogni kezdenek: a legkisebb darab a leggyorsabban, a legnagyobb a leglassabban, és így tovább. A DNS-darabok ezért méretüknek megfelelően sorba rendeződnek, majd egy lézer előtt elhaladva a jelölt nukleotidon lévő fluoreszcens anyag gerjesztődve kibocsátja a jelölésnek megfelelő hullámhosszú fényt, amely megfelel a beépült nukleotid minőségének. Ezeket a jeleket egy detektor rögzíti, s leolvasás végére megszületik az eredeti egyszálú DNS molekula kiegészítő, komplementer szálának szekvenciája (forrás: University of California, Davis)

Noha a kutatócsoport emberi DNS leolvasásával még nem próbálkozott, azt ígérik, hogy nyolc héten belül 72 000 dollárból képesek lesznek előállítani egy teljes humán szekvenciát. A készüléket 1,35 millió dollárért hoznák forgalomba. Összehasonlításként: a Human Genom Project tíz év alatt valósult meg, s hozzávetőleges összesen 300 millió dollárba került.

Az új módszer megoldást kínál az ismétlődő szekvenciák leolvasására is

Az eukarióta élőlények DNS-e jelentős mértékben tartalmaz ismétlődő szekvenciákat. Az ismétlődő szekvenciák elhelyezkedhetnek a DNS-molekulán egymás mellett, de egymástól távol is eshetnek, méretük, számuk nagyon változatos lehet. Fehérjét nem kódolnak. Eredetük még nem tisztázott, sőt az azonosításuk sem fejeződött be. Annyi azonban bizonyos, hogy a genom igen nagy hányadát kitehetik.

A hosszú ismétlődések bázissorendjének leolvasása ezidáig nagyon nehézkesen működött, mert a fentebb ismertetett, napjainkban használatos egyik módszer sem teszi lehetővé egy hosszan ismétlődő szakaszt pontos leolvasását és összeillesztését. Az egyedi molekulaleválasztó technológiával viszont - mivel a bázisok leolvasása "kihorgonyzott" állapotban történik - minden egyes bázispárt meg lehet jeleníteni, tehát a teljes ismétlődés szekvenciája előállítható. Emellé Harrisék kifejlesztettek egy saját szekvencia-összeillesztő programot is, amellyel állításuk szerint egy teljes emberi DNS szekvenciájának a 85%-át képesek lesznek összefűzni. Ez pedig - Harris szerint - több mint elegendő információt szolgáltat a személyre szabott genetikai vizsgálatok elvégzéséhez.

Török Katalin

Forrás: Harris, T. D. et al. Science 320, 106-109 (2008). | Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome