Röntgen 1894-ben a Würzburgi Egyetem fizikusaként kezdte el a katódsugarakkal kapcsolatos kutatásait. A rákövetkező évben figyelt fel arra a jelenségre, hogy a kisülési cső mellett heverő, és fekete papírba csomagolt fényképezőlemezek az előhívásuk után elfeketedtek.
1895 november 8-án kísérleti jelleggel fekete kartonpapírba csomagolta a kisülési csövet, így próbálta megvizsgálni a katódsugár fényét. Amikor feszültség alá helyezte a csövet, meglepődve tapasztalta, hogy a cső közelében fekvő bárium-platina-cianoiddal bevont ernyő fluoreszkáló fényt bocsát ki.
A katódsugárcső indukálta fény tanulmányozása közben megdöbbenve észlelte, hogy a titokzatos sugár hatására az ernyő akkor is világított, ha a cső és az ernyő közé a jegyzetfüzetét, vagy egy deszkalapot illesztett. Amikor a tenyerét tette a kisülési cső elé, egészen megdöbbent; az ernyőn ugyanis saját kézfejcsontjainak az árnyéka jelent meg.
A mindenen áthatoló fénysugárzás csak akkor szűnt meg, amikor a kisülési csőről lekapcsolta a feszültséget. Hamarosan arra is rájött, hogy a rejtélyes fény forrása nem a katódsugárzás, ugyanis a katódsugarak már néhány centiméter vastag légrétegben elnyelődnek, ezzel szemben a csőtől másfél-kétméteres távolságra elhelyezett ernyő továbbra is világított.
Az elkövetkező hetekben minden idejét a jelenség tanulmányozására fordította. Megfigyelte, hogy az általa X-nek elnevezett és a cső meghatározott részéből kiáramló, és mindenen áthatoló sugárzás – a fényhez hasonlóan – egyenes vonalban terjed, és nyomot hagy a fényképezőlemezen. A világ első röntgenfelvételét 20 perces expozícióval felesége kezéről készítette el.
A felfedezésének leglényegesebb megállapításait magába foglaló közleményt éppen 119 évvel ezelőtt, 1895 december 28-án nyújtotta át a würzburgi Fizikai-Orvosi Társaságnak, ahol bő három héttel később, 1896 január 23-án részleteiben is beszámolt felfedezéséről. A tudós társaság ekkor vetette fel, hogy az X-sugárzást felfedezőjéről Röntgen-sugárzásnak nevezzék el. Újabb és részletes megfigyeléseiről 1896 márciusában számolt be, és az ekkor bemutatott, általa demonstrációs célból megkonstruált eszköz lett a Röntgen-készülékek előfutára.
Röntgen kutatásai világszerte nagy feltűnést keltettek, felfedezésének jelentőségét már a kortársai is felismerték. Kutatási eredményeit 1901-ben a legrangosabb tudományos kitüntetéssel, a Nobel-díj odaítélésével ismerték el. A világhírű tudós 77 éves korában, 1923 február 10-én, Münchenben hunyt el.